干细胞（Stem cells）是未分化的或部分分化的细胞,具有自我更新和多次分化的能力。在一定条件下，可分化成多种功能细胞。未充分分化的干细胞因具有再生各类组织器官和人体的潜在功能，被称为“万用细胞”。常见干细胞培养有造血干细胞(HSC)，胚胎干细胞(ESC)，神经干细胞(NSC)，多功能干细胞(iPSC)，间充质干细胞(MSC)等干细胞培养。由于干细胞具有再生组织和修复的潜力，来替换身体里受损或生病的细胞，因此在自身免疫性疾病、神经系统性疾病、心血管类疾病、骨骼系统疾病、眼科类疾病以及代谢性类疾病等领域有着广泛的应用前景。

2006年，山中伸弥等科学家把4个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成多功能干细胞（iPSC），意味着体细胞能够被改造发展成所有类型细胞，开启了干细胞研究的新纪元。目前，国内已批准成立干细胞临床研究备案机构近150余家，通过审批备案的干细胞临床研究已达140余项。

二维培养（传统）：是指将干细胞浸入到培养液中，在普通的玻璃或塑料材质的培养瓶表面，沿着二维平面延伸生长。

图为：3D细胞培养模式图[1]

复苏

稀释前将Ceturegel®基质胶和适量体积的DMEM/F12放入4度冰箱过夜融化。将融化的Ceturegel®基质胶和DMEM/F12从冰箱取出并打开盖子，10ml移液管吸吹DMEM/F12几次以冷却移液管，并吸取适量DMEM/F12加入装有Ceturegel®基质胶的容器中混匀，4度保存，1个月内使用，-20或-80度可保存半年以上。

吸取适量稀释的Ceturegel®基质胶（货号40190，稀释比例按1：80~1：160，浓度约为10mg/ml为基准）置于6孔板中，轻轻摇晃，使Ceturegel®基质胶均匀平铺于孔板底部，培养箱放置1h以上，种细胞前弃掉，之后每次传代也要先培养器皿内铺胶包被。将H9（人胚胎干细胞）细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。将冻存管内细胞悬液转移至含3~4ml的H9完全培养液的15ml离心管内，以1000rpm，离心5min。离心后将上清液吸除，轻弹离心管底，使细胞沉淀松散，加入新鲜的H9完全培养液2~3ml，轻轻吹打一次使细胞克隆块悬浮。转移至已经铺好Ceturegel®基质胶的6孔板中培养。复苏第二天不换液，第三天起每天更换H9细胞完全培养液。

传 代

一般在复苏后第7~10天传代，之后常规传代为6-7天一次。吸除废液。用DPBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。03 加入2~3ml的1mg/ml的干细胞专用消化液至培养瓶，轻轻晃动，使之覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。在显微镜下观察，直至克隆脱落（一般需要3~6min）。将带有脱落克隆的消化液转移至15ml离心管中，放置一会，待克隆自然沉降后将上层吸除，加入H9完全培养液3ml轻轻混匀，放置一会，待克隆自然沉降后将上层培养液吸除，重复一次（即H9完全培养液漂洗2遍，沉降后吸掉上清）。加入H9完全培养液3ml，用1ml移液器吹打2-3次，将克隆块吹散成大小为原来的约1/10（若想得到大小较均一的克隆块，此时可将细胞静置片刻，待细胞自然沉降后取悬浮于液体中间层的克隆块传代），传代比例根据母瓶克隆密度和大小而定，一般1:3~1:5传代。放入37℃培养箱内培养。

冻 存

按传代的方法将细胞消化下来，漂洗后细胞沉于离心管底部。冷冻比例根据母瓶克隆密度和大小而定，一般1个T25培养瓶可冷冻1-3个冻存管。向离心管内加入1/2冷冻体积的H9完全培养液，轻轻混匀。逐滴加入已经预冷（4℃）的细胞冻存液，一边加一边轻轻晃动离心管。移液器轻轻混匀细胞（保持克隆块，不可吹打过度），每支冻存管内加入500ul~lml细胞悬液，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。

• 三维培养细胞增殖速度相对于二维培养可能更快或更慢，此增殖速度更接近体内细胞的增殖速度；

• 三维培养能够更好的模拟体内细胞形态学和生理学：三维培养的细胞对药物及理化刺激的反应会更接近于体内生理状态下的细胞，能够独立评估微环境的不同特征来调节组织器官发生和疾病等；

• 三维细胞培养有助于我们对复杂的生物机制进行研究，比如成骨细胞如何诱导为骨细胞，且这一研究过程是可重复的；

• 在需要进行大批量细胞培养时，三维培养干细胞在空间、人工、试剂耗材与时间上的成本要远低于二维培养。